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液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)同时定量分析人体血浆中45种胆汁酸

更新时间:2024-07-08      点击次数:334

胆汁酸被认为是一类重要的生物标志物,或者被认为可在代谢性疾病的治疗中发挥作用。由于胆汁酸存在多种异构体以及检测方法灵敏度的限制,同时进行多种胆汁酸定量分析的工作仍是一个挑战。岛津中国创新中心与北京大学第三医院药物临床试验机构刘东阳研究员课题组合作开发一种准确、灵敏的液相色谱三重四极杆串联质谱法(LC-MS/MS),以进行多种极性相近胆汁酸的同时定量检测。通过将开发的定量分析进一步应用于健康人群血浆样本的测试,对其中35个胆汁酸进行定量分析,用以观察葡萄糖摄入后血浆中胆汁酸的动态分布特征。相关成果以“Isomers-oriented separation of forty-five plasma bile acids with liquid chromatography-tandem mass spectrometry"为题,发表在化学期刊《Journal of Chromatography A》(doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464827)


背景介绍

胆汁酸(Bile acids, BAs)由肝脏合成,胆囊分泌,可分为游离胆汁酸和结合胆汁酸,以及初级胆汁酸和次级胆汁酸。胆汁酸从胆固醇起始,通过细胞色素酶(CYP酶)的两种合成途径,最终形成初级胆汁酸,即胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)。这些初级胆汁酸在肝脏中与甘氨酸或牛磺酸反应形成结合胆汁酸,储存在胆囊中,随胆汁排入肠道。在肠道微生物群的作用下,结合胆汁酸被水解,重新生成游离胆汁酸,游离胆汁酸经过氧化还原反应生成次级胆汁酸,如脱氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)和石胆酸(LCA),大多数胆汁酸会被肠道重吸收并进入肠肝循环。


近年来研究结果表明,胆汁酸与代谢紊乱(包括葡萄糖和脂质代谢以及能量平衡)中的生理变化密切相关,在生理和病理方面发挥着重要作用,因此人体血浆中的胆汁酸的定性和定量研究至关重要。然而目前分析方法在胆汁酸异构体的分离和灵敏度上无法兼顾,这为多种胆汁酸的同时定量提出了更高的分析要求。


本研究建立了LC-MS/MS同时定量人体血浆样品中45种胆汁酸的分析方法。该方法以异构体分离为导向,使用9种稳定同位素内标,经过对色谱及质谱条件的优化后,可同时准确定量分析45种胆汁酸的人体血浆浓度,并保证均获得0.05-10 ng/mL的定量下限。系统适用性、线性相关系数、可靠性、准确度和精密度等相关结果,均满足方法学要求,本研究所建立的质谱定量方法具有较高的灵敏度和更高的分离能力。


实验条件:

本工作使用岛津液相色谱-三重四极杆串联质谱LCMS-8060NX进行方法开发、验证及实验样品检测。


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LC分离参数:

流动相A:水+0.01%甲酸;流动相B:乙腈+0.01%甲酸

色谱柱:ACE EXCEL 1.7 C18 (2.1mm*100mm, 1.7μm)

流速:0.25mL/min

柱温:45℃

进样量:3μL


质谱检测参数:

离子化模式:ESI,负离子模式;雾化气:2L/min;干燥气:10L/min; 加热气:10L/min; 接口温度:300℃;

脱溶剂管线DL温度:250℃;加热模块温度:400℃。


实验结果

图2显示45种目标胆汁酸及9种内标的MRM离子流图,各化合物得到良好分离,且无明显干扰。对该方法进行方法学验证,获得良好的系统适用性、基质效应、残留效应、稀释可靠性、准确度、精密度、线性及稳定性结果,证明分析方法的可靠性。

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对进行静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)的12个健康中国志愿者在不同时间点(基线区间及摄入葡萄糖后,0-240min)采集的共180个血浆样品进行检测。共计35种胆汁酸被检出,其中27种符合定量分析标准要求(在超过2/3的个体样品中可被准确定量分析)。代表性胆汁酸的浓度-时间变化曲线如图3所示。根据检测结果,在进行糖分摄入后,游离型胆汁酸与结合型胆汁酸显示不同的变化规律。游离型胆汁酸浓度在整个实验过程中持续性下降,而同时结合型胆汁酸会在起始阶段先出现下降而后在特定时间点发生反弹,表明存在不同的因素影响两种类型胆汁酸发生变化。

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对比IVGTT过程中胆汁酸浓度-时间曲线与血糖浓度变化趋势,图4对比了游离型胆汁酸CDCA、结合型胆汁酸TCA以及总胆汁酸与血糖、胰岛素的变化过程。在给予静脉葡萄糖注射后,游离型胆汁酸与葡萄糖均呈现快速的清除速率,显示血浆中浓度的快速下降。结合型胆汁酸在注射葡萄糖60min内显示与游离胆汁酸类似的变化趋势,但是之后出现浓度的明显上升。总胆汁酸的变化趋势与游离型胆汁酸CDCA的变化趋势更加接近。

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小结:

综上所述,本工作基于岛津液相色谱三重四极杆质谱法(LC-MS/MS)建立了同时准确定量生物样本中45种胆汁酸的分析方法,并将该方法进一步应用于检测葡萄糖耐受实验后健康人群血浆中胆汁酸的变化。研究结果表明,胆汁酸、葡萄糖和胰岛素的变化之间存在一定的相关性,其具体机制还需进一步研究调查。

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